Der Ort, an dem die Katakombe von San Sebastiano steht, war in der Antike eine tiefe Senke, die als Puzzolan-Steinbruch genutzt wurde und ad catacumbas (oder “bei den Höhlen”) genannt wurde, ein Name, der zum Synonym für einen unterirdischen Friedhof geworden ist.

Seit dem ersten Jahrhundert wurde die Stätte intensiv genutzt und bebaut: Die unterirdischen Gänge wurden zur Gewinnung von Grabnischen umgenutzt, an der Oberfläche hingegen entstanden mehrere Kolumbarien und mindestens zwei Wohnanlagen (die sogenannte kleine Villa und die große Villa), die mit bemerkenswerten bildlichen Wanddekorationen ausgestattet sind.

Um die Mitte des zweiten Jahrhunderts wurde der Talboden eingegraben, um einen Platz zu schaffen, auf dessen einer Seite nacheinander drei Mausoleen errichtet wurden (von Clodius Hermes, von den Innocentiores, von der Axt).

Eine weitere Verschüttung des Geländes wurde vorgenommen, um Platz für den Bau der Triclia zu schaffen, einer Säulenhalle, die von einer Mauer begrenzt wird, auf der zahlreiche Graffiti Aufrufe an die SS richten. Petrus und Paulus, die um 250 gemeinsam an diesem Ort verehrt wurden.

Der Kaiser Konstantin (306-337) ließ an dieser Stelle eine Basilika in Form eines römischen Zirkus errichten (genannt “circiforme”).

Bereits im dritten Jahrhundert begann die Katakombe, in der sich die Gräber der Märtyrer Sebastian und Eutichio befanden, unterirdisch zu entstehen.